Q&A in AGH635 Course: Mapping Population Part 2 – F2 Intercross

Linkage analysis

Linkage between female and certain disease in human genetic. Figure Source http://genome.crg.es

Setelah memahami mengapa perlu membuat Mapping Population sebagaimana yang dijelaskan dalam posting sebelumnya [lihat Q&A in AGH635 Course: Mapping Population Versus Association Map (Association Linkage) Analysis], pertanyaan berikutnya adalah bagaimana dan apa saja macam Mapping Population yang dapat digunakan? Dalam beberapa seri posting selanjutnya akan diungkap jawaban dari pertanyaan-pertanyaan tersebut. Harapannya, informasi yang disampaikan dapat menjadi bahan pertimbangan bagi mahasiswa pascasarjana yang akan atau sedang menulis thesis S2 atau disertasi S3 ataupun staf pengajar (peneliti) yang dalam proses atau sedang melakukan penelitian dengan topik analisis molekuler.

Berkaitan dengan hal tersebut, salah satu tipe atau bentuk Mapping Population yang dapat digunakan dalam penelitian dan analisis molekuler adalah Populasi F2-Intercross. Untuk memahami apa itu dan bagaimana proses pembuatan Populasi F2-Intercross, ada baiknya kita bersama-sama mencoba mengkaji beberapa ilustrasi di bawah ini:

  • F2 Intercross

    Gbr. 1. Proses pembuatan Mapping Population F2 Intercross dari dua tetua yang homosigot. Sebagai ilustrasi, tetua P1 sebagai donor sifat resisten yang akan dipelajari dan P2 sebagai tetua rentan.

    CASE A: ada dua tanaman (P1 dan P2) yang merupakan galur murni (i.e. lokus-lokus di dalam genomnya mempunyai alel dalam kondisi homosigot). Tanaman P1 diketahui merupakan donor sifat resisten sedangkan tanaman P2 bersifat rentan. Antara P1 dan P2 diketahui mempunyai jarak genetik yang besar sehingga masing-masing tetua (P1 versus P2) jika dianalisis dengan marka molekuler akan bersifat polimorfik. Persilangan antara P1 dan P2 dilakukan untuk mendapatkan sejumlah benih F1 yang genotipenya homogeneous. Benih F1 ditanam dan dipelihara hingga berbuah. Selfing dilakukan terhadap sejumlah tanaman F1 dan benih yang dipanen adalah benih F2. Benih F2 ditanam sehingga menghasilkan populasi tanaman F2. Populasi tanaman F2 tersebut dapat digunakan sebagai Mapping Population dan dikenal sebagai Populasi F2-Intercross (Gbr. 1).

F2 Intercross

Gbr. 2. Proses pembuatan Mapping Population F2 Intercross dari tetua yang heterosigot. Sebagai ilustrasi, tetua P1 (donor sifat resisten yang akan dipelajari), diketahui genotipenya heterosigot dan P2 sebagai tetua rentan.

  • CASE B: ada dua tanaman (P1 dan P2) yang jelas-jelas bukan merupakan galur murni (tidak yakin lokus-lokusnya ada dalam kondisi homosigot). Status genotipe tanaman P1 heterosigot dan P2 tidak diketahui (apakah homosigot atau heterosigot). Tanaman P1 diketahui merupakan donor sifat resisten sedangkan tanaman P2 bersifat rentan. Antara P1 dan P2 diketahui mempunyai jarak genetik yang besar sehingga masing-masing tetua (P1 versus P2) jika dianalisis dengan marka molekuler akan bersifat polimorfik. Persilangan antara P1 dan P2 dilakukan untuk mendapatkan sejumlah benih F1 yang genotipenya heterogeneous. Benih F1 ditanam dan diinokulasi dengan patogen penyebab penyakit yang dievaluasi. Setelah diinokulasi, dipilih satu tanaman F1 yang resisten dan dipelihara hingga berbuah. Selfing dilakukan terhadap satu tanaman F1 terpilih yang resisten dan benih yang didapat dipanen sebagai benih F2. Benih F2 ditanam sehingga menghasilkan populasi tanaman F2. Populasi tanaman F2 tersebut dapat digunakan sebagai Mapping Population dan dikenal sebagai Populasi F2-Intercross (Gambar 2).
Populasi RIL

Gbr. 3. Berangkat dari populasi F2 (Gbr. 1) – dapat dihasilkan populasi Recombinant Inbreed Lines (RIL) melalui proses Single Seed Descent (SSD) selama beberapa generasi. RIL dapat digunakan sebagai Mapping Population.

  • CASE C: berangkat dari CASE A atau CASE B tersebut di atas – setelah mendapatkan populasi tanaman F2, masing-masing tanaman F2 di-selfing dan dari  masing-masing tanaman dipanen benihnya (benih F3) dan benih F3 yang dipanen dari masing-masing tanaman F2 dipisahkan sebagai satu famili benih F3. Selanjutnya, dari setiap famili benih F3 turunan dari masing-masing tanaman F2, diambil satu benih F3 dan ditanam hingga panen (single seed descent=SSD).
Populasi RIL

Gbr. 4. Dengan populasi F2 yang berasal dari tetua P1 heterosigot – juga dapat dihasilkan populasi Recombinant Inbreed Lines (RIL) dengan skenario yang sama seperti pada Gbr. 3, yaitu proses Single Seed Descent (SSD) selama beberapa generasi. RIL dapat digunakan sebagai Mapping Population.

  • Demikian seterusnya, SSD dilakukan 6-10 generasi (Gambar 3 dan 4) dan pada generasi ke-6 atau ke-10 akan didapatkan populasi tanaman yang dapat digunakan sebagai Mapping Population. Mapping Population tersebut disebut sebagai populasi Recombinant Inbreed Lines (RIL).

Mari kita simak tiga kasus yang diuraikan diatas. Pada CASE A dan B diatas, Mapping Population F2-intercross merupakan populasi yang mempunyai tingkat keragaman intra-populasi yang tertinggi dibandingkan dengan populasi lain (ini merupakan kelebihan dari populasi F2 intercross). Individu-individu dalam Mapping Population yang dibuat sebaiknya minimal sebanyak 180-200 individu (ini merupakan kekurangan dari populasi F2 intercross).

Populasi RIL juga mempunyai tingkat keragaman intra-populasi yang tinggi sebagaimana populasi F2 intercross. Pada populasi RIL, jumlah kelas genotipe yang tadinya ada tiga (misalnya: AA, aa, dan Aa) pada populasi F2 Intercross, tinggal menjadi dua (misalnya: AA dan aa) saja (ini merupakan kelebihan dari populasi RIL). Namun demikian, untuk merealisasikan kelebihan tersebut diperlukan proses SSD selama 6-10 generasi.

Pada masing-masing individu dalam populasi F2 Intercross, untuk masing-masing lokus tertentu akan dijumpai ada tiga macam kemungkinan genotipe yaitu: homosigot/Hm (AA) yang dalam ilustrasi pada Gbr. 1 dan Gbr. 2 akan diberi kode tipe “A”, homosigot/hm (aa) atau tipe “B”, dan heterosigot (Aa) atau tipe “H.” Simbol A, B, atau H merupakan simbol genotipe untuk masing-masing individu F2, yang akan digunakan dalam analisis linkage atau dalam pembuatan linkage map.

Pada populasi RIL, hanya dijumpai ada dua macam genotipe yaitu: Hm (AA) yang dalam ilustrasi pada Gbr. 3 dan Gbr. 4 akan diberi kode tipe “A” dan hm (aa) atau tipe “B.” Simbol A dan B merupakan simbol genotipe untuk masing-masing individu dalam populasi RIL, yang akan digunakan dalam analisis linkage atau dalam pembuatan linkage map. Pada populasi RIL, individu dengan genotipe “H” (Aa) tidak lagi dijumpai sebagai akibat tahapan SSD yang dilakukan selama 6-10 generasi.

Jika setiap individu dalam Mapping Population F2 intercross dianalisis dengan menggunakan marker yang dominan (seperti marker RAPD, AFLP, atau ISSR), maka individu Hm (AA) atau tipe “A” dan individu Ht (Aa) atau tipe “H” akan mempunyai skor yang sama (i.e. RAPD, AFLP, dan ISSR tidak dapat membedakan antara individu dengan genotipe Hm (AA) atau tipe “A” dengan individu bergenotipe Ht (Aa) atau tipe “H.”). Individu dengan dua  kelas genotipe tersebut akan diskor (+) untuk marka yang bersifat dominan. Yang dapat ditentukan genotipenya dengan pasti adalah individu dengan skor (-) karena akan mempunyai genotipe hm (aa). Untuk itu, simbol genotipe individu dengan skor (+) yang bisa AA atau Aa diganti dengan “bukan tipe B” karena tipe B genotipenya (aa) dan simbolnya diganti dengan ”C”. Dengan analogi yang sama, individu F2 dengan skor (+) yang bisa BB atau Bb diganti dengan “bukan tipe A” karena tipe A genotipenya (aa) dan simbolnya diganti dengan “D” .

Tetapi jika Mapping Population-nya adalah RIL, maka hanya ada individu dengan kemungkinan genotipe Hm (AA) atau hm (aa). Sehingga, kalau dianalisis dengan marker dominan maka individu yang mempunyai skor (+) biasanya genotipenya Hm (AA) atau tipe “A” (untuk Gbr. 3 atau Gbr. 4). Sebaliknya, individu yang mempunyai skor (-), genotipenya hm (aa) atau tipe B (untuk Gbr. 3 dan Gbr. 4). Dengan demikian, meskipun digunakan marker yang sifatnya dominan, tetap akan dapat mengidentifikasi genotipe individu dengan skor (+) sebagai (AA) atau tipe “A” dan yang skor (-) sebagai (aa) atau tipe “B.”

Jika marker molekuler yang digunakan untuk analisis individu-individu tanaman dalam populasi F2 intercross atau populasi RIL adalah marker yang bersifat co-dominan (marker SSR atau marker SSCP), maka tidak akan muncul potensi masalah sebagaimana yang dijelaskan dalam uraian sebelumnya. Individu dengan genotipe Hm (AA) atau tipe “A” akan dapat dengan mudah dibedakan dari genotipe Ht (Aa) atau tipe “H” dan dari individu dengan genotipe hm (aa) atau tipe “B.”

Dari penjelasan di atas dapat ditarik kesimpulan bahwa: Mapping Population F2 intercross dan RIL merupakan populasi dengan keragaman intrapopulasi yang tinggi. Mapping Population F2 intercross lebih sederhana dalam prosesnya, tetapi ada individu-individu dalam kondisi heterosigot Ht (Aa) yang tidak dapat dibedakan dengan individu Hm (AA) ketika menggunakan marker yang dominan. Sebaliknya Mapping Population RIL lebih kompleks penyiapannya, tetapi tidak lagi ada individu dengan genotipe Ht (Aa) dan marker molekuler yang bersifat dominan akan mampu mengidentifikasi individu dengan skor (+) sebagai individu dengan genotipe Hm (AA). Populasi mana yang akan dibuat untuk mendukung pelaksanaan penelitian analisis linkage sangat tergantung pada pilihan peneliti dan sumberdaya yang tersedia.

Semoga ulasan dari beberapa pertanyaan yang sering mengemuka dalam diskusi di kelas atau ketika membaca thesis/disertasi mahasiswa SPS IPB tersebut ada manfaatnya. Semoga juga dapat menjadi sepotong kecil ‘gading atau belang‘yang dapat ditinggalkan bagi kolega yang membacanya. Feedback dan masukan dari teman-teman sangat diharapkan untuk meningkatkan pemahaman bersama.

Baca juga (Read also):

About PMB Lab: Prof. Sudarsono

This blog is dedicated as a communication media among alumni associated with PMB Lab, Dept. of Agronomy and Horticulture, Fac. of Agriculture, IPB, Bogor – Indonesia. It contains various information related to alumni activities, PMB Lab’s on going activities and other related matters.
This entry was posted in Kuliah (Courses), Q & A and tagged , , , , , . Bookmark the permalink.

4 Responses to Q&A in AGH635 Course: Mapping Population Part 2 – F2 Intercross

  1. Dalam Case A: Digunakan tetua P1 dan tetua P2 yang keduanya homosigot. Dalam kondisi demikian, tidak memerlukan penanganan khusus untuk menghasilkan populasi F2-Intercross. Sebagai tambahan informasi, jika dari satu tanaman F1 ternyata hanya bisa dipanen sebanyak 10 benih F2/tanaman F1 sedangkan yang diperlukan adalah 200 benih F2 maka 200 benih F2 dapat dipanen dari 20 tanaman F1 dan dicampur sebagai Mapping Population F2-Intercross. Sebagai contoh, jika dari tanaman F1-1 dipanen 10 benih, F1-2: 10 benih, dan seterusnya, maka 200 benih F2 dapat diperoleh minimal dari 20 tanaman F1.

  2. Dalam Case B: Tetua P1 dan P2 jelas-jelas bukan tetua homosigot sehingga populasi F1 yang dihasilkan heterogeneous. Inokulasi tanaman F1 dengan patogen bertujuan untuk memastikan bahwa F1-nya membawa sifat dari tetua donor (sebagai sifat yang akan diasosiasikan dengan marker). Selain resisten, F1 yang dipilih sebaiknya membawa sebanyak mungkin marker-marker yang muncul di tetua P1 dan tidak muncul atau berbeda alelnya dengan tetua P2 (marker P1-specific). Hal ini perlu dilakukan karena gen pengendali fenotipe yang akan dievaluasi berasal dari tetua P1. Benih F2 yang ditanam dari satu tanaman F1 terpilih tersebut menghasilkan populasi tanaman F2 dan dapat digunakan sebagai Mapping Population yang setara sebagai populasi F2-Intercross. Jika dari satu tanaman F1 hanya bisa dipanen sedikit benih F2, padahal yang diperlukan 200 benih, maka satu tanaman F1 terpilih yang akan dijadikan sebagai tetua dapat diperbanyak secara klonal baru diselfing untuk menghasilkan populasi F2-Intercross.

  3. Jika menggunakan marker dominan M:
    Persilangan antara tetua P1 (+/+) dan P2 (-/-) akan menghasilkan populasi tanaman F1 yang heterosigot (+/-) dan homogeneous (genotipenya semua sama). Tanaman F2 hasil selfing tanaman F1, bersegregasi untuk skor (+) dengan genotipe (+/+) atau (+/-) dan skor (-) dengan genotipe (-/-). Dalam hal ini, pada populasi F2 – individu skor (+) dengan genotipe (+/+) tidak dapat dibedakan dengan individu skor (+) yang genotipe (+/-).

    Jika diasumsikan bahwa tetua P1 mempunyai skor marker dominan M (+) dan genotipenya (+/+) sedangkan P2-nya skor (-) dan genotipanya (-/-) maka individu F2 yang skor (+) diberi simbol genotipe “C” yang artinya yakin bukan tipe “B” karena yang tipe B adalah (-/-). Sebaliknya tidak yakin apakah individu F2 yang skor (+) tersebut genotipenya (+/+) (tipe “A”) atau (+/-) (tipe “H”).’ Dengan demikian, tipe “C” artinya mempunyai genotipe yang pasti bukan tipe “B” tetapi tidak pasti apakah (+/+) (tipe A) ataukah (+/-) (tipe “H”).

    Jika diasumsikan bahwa tetua P1 mempunyai skor marker dominan M (-) dan genotipenya (-/-) sedangkan P2-nya skor (+) dan genotipenya (+/+) maka individu F2 yang skor (+) diberi simbol genotipe “D” yang artinya yakin bukan tipe “A” karena yang tipe A adalah (-/-). Sebaliknya tidak yakin apakah individu F2 yang skor (+) tersebut genotipenya (+/+) (tipe “B”) atau (+/-) (tipe “H”).’ Dengan demikian, tipe “D” artinya mempunyai genotipe yang pasti bukan tipe “A” tetapi tidak pasti apakah (+/+) (tipe B) ataukah (+/-) (tipe “H”).

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s