Q&A in AGH635 Course: Mapping Population Part 3 – F2 Backcross dan Populasi yang Terkait

Gbr. 1. Skenario back crossing secara konvensional dan pemanfaatan marker molekuler untuk percepatan proses back crossing. Sumber gambar: http://www.knowledgebank.irri.org/ricebreedingcourse/image99.jpg

Dalam posting sebelumnya telah dibahas tentang pemtingnya membuat Mapping Population [lihat Q&A in AGH635 Course: Mapping Population Versus Association Map (Linkage) Analysis] dan contoh bentuk Mapping Population yang berupa F2 Intercross (lihat: Q&A in AGH635 Course: Mapping Population Part 2 – F2 Intercross). Dalam posting ini diilustrasikan macam Mapping Population lain, yaitu F2 Backcross dan populasi turunannya. Harapannya, informasi ini dapat menjadi bahan pertimbangan bagi mahasiswa pascasarjana yang akan atau sedang menulis thesis S2 atau disertasi S3 ataupun staf pengajar (peneliti) yang dalam proses atau sedang melakukan penelitian dengan topik analisis molekuler.

Untuk membahas apa itu dan bagaimana proses pembuatan Populasi F2-Backcross, ada baiknya kita bersama-sama mencoba memahami beberapa ilustrasi di bawah ini:

F2 Backcross

Gbr. 1. Proses pembuatan Mapping Population F2 Backcross dari tetua yang homosigot. Sebagai ilustrasi, tetua P1 (donor sifat resisten yang akan dipelajari) dan P2 sebagai tetua rentan.

    • CASE A: ada dua tanaman (P1 dan P2) yang merupakan galur murni (i.e. lokus-lokus di dalam genomnya mempunyai alel dalam kondisi homosigot). Tanaman P1 diketahui merupakan donor sifat resisten sedangkan tanaman P2 bersifat rentan. Antara P1 dan P2 diketahui mempunyai jarak genetik yang besar sehingga masing-masing tetua (P1 versus P2) jika dianalisis dengan marka molekuler akan bersifat polimorfik. Persilangan antara P1 dan P2 dilakukan untuk mendapatkan sejumlah benih F1 yang genotipenya homogeneous. Benih F1 ditanam dan dipelihara hingga berbunga. Backcrossing dilakukan dengan menyilangkan tetua P1 atau tetua P2 dengan sejumlah tanaman F1 dan benih yang dipanen adalah benih BC1. Benih BC1 ditanam sehingga menghasilkan populasi tanaman BC1. Populasi tanaman BC1 tersebut dapat digunakan sebagai Mapping Population dan dikenal sebagai Populasi F2-Backcross (Gbr. 1).
Test cross

Gbr. 2. Proses pembuatan Mapping Population F2 Backcross (test cross). Setelah dapat F1 yang heterosigot, disilangkan dengan tetua selain P1 atau P2 (misal P10) yang alel-alel dalam lokusnya resesif. Tetua P1 sebagai donor sifat resisten yang akan dipelajari.

      • CASE B: seperti halnya dalam Gbr. 1, dihasilkan populasi tanaman F1 yang homogeneous. Untuk pembuatan populasi Testcross, tidak digunakan salah satu tetua P1 atau P2, tetapi digunakan tanaman tester P10. Tanaman P10 mempunyai alel pada lokus-lokusnya yang kebanyakan alel resesif. Tanaman P1 diketahui merupakan donor sifat resisten sedangkan tetua P2, P10 atau tetua tester lainnya yang digunakan  bersifat rentan. Antara P1 dan P2 atau tetua tester yang digunakan diketahui mempunyai jarak genetik yang besar sehingga jika dianalisis dengan marka molekuler akan bersifat polimorfik. Benih TC1 ditanam sehingga menghasilkan populasi tanaman TC1. Populasi tanaman TC1 tersebut dapat digunakan sebagai Mapping Population dan setara dengan Populasi F2-Backcross (Gbr. 2).
  • Populasi NIL

    Gbr. 3. Berangkat dari populasi BC1 (Gbr. 1) – dapat dihasilkan populasi Near Isogenic Lines (NIL) melalui proses continuous backcrossing (continuous BC) selama beberapa generasi. NIL dapat digunakan sebagai Mapping Population.

    CASE C: berangkat dari CASE A atau CASE B tersebut di atas – setelah mendapatkan populasi tanaman BC1 atau TC1, masing-masing tanaman BC1 atau TC1 yang heterosigot dipilih dan disilangkan dengan tetua P1 atau tetua P2-nya (atau P10 untuk test cross) dan dari  masing-masing persilangan dipanen benihnya (benih BC2 atau TC2) dan benih BC2 atau TC2 yang dipanen dari masing-masing induk BC1 atau TC1 dipisahkan sebagai famili. Selanjutnya, dari setiap famili benih BC2 atau TC2 yang didapat, ditanam dan dipilih individu yang heterosigot untuk disilangkan kembali dengan tetua P1 atau tetua P2 (atau P10 untuk testcross – continuous backcrossing atau testcrossing=continuous BC atau TC).

Populasi NIL

Gbr. 4. Dengan populasi TC1 yang berasal dari test cross dengan tetua P10, dipilih individu yang heterosigot dan disilangkan dengan tetua tester yang alel-alelnya resesif. Setelah 6-10 generasi TC juga dapat dihasilkan populasi Near Isogenic Lines (NIL). NIL yang didapat dapat digunakan sebagai Mapping Population.

      • Demikian seterusnya, continuous BC atau TC dilakukan 6-10 generasi (Gambar 3 dan 4) dan pada generasi 10 – galur BC10 atau TC10 yang didapat akan diselfing dan diperoleh populasi tanaman yang dapat digunakan sebagai Mapping Population. Mapping Population tersebut dikenal sebagai populasi Near Isogenic Lines (NIL).

Mari kita simak tiga kasus yang diuraikan diatas. Pada CASE A dan B diatas, Mapping Population F2-Backcross merupakan populasi yang dihasilkan melalui paling sedikit dua kali controlled polination dan dengan tingkat keragaman intra-populasi yang lebih kecil dibandingkan dengan populasi F2 Intercross (ini merupakan kekurangan dari populasi F2 Backcross). Individu-individu dalam Mapping Population yang dibuat sebaiknya minimal sebanyak 90-100 individu (ini merupakan kelebihan dari populasi F2 Backcross).

Populasi NIL dibuat dengan tujuan agar lokus-lokus di dalam genomnya sebagian besar dalam kondisi homosigot dan hanya sebagian kecil lokus sisanya saja yang masih dalam kondisi heterosigot (lokus-lokus target yang diinginkan saja yang dalam keadaan heterosigot). Pada populasi NIL, jumlah kelas genotipe yang ada hanya AA atau aa saja untuk mayoritas lokus di dalam genom tanamannya. Namun demikian, untuk sejumlah lokus target yang diinginkan – genotipenya masih ada dalam kondisi heterosigot Aa.

Pada generasi BC10, galur backcross yang didapat diselfing, sehingga untuk lokus-lokus target akan terjadi segregasi menjadi AA, Aa, dan aa. Sebaliknya, selain lokus target, maka semua genotipenya akan homosigot (AA atau aa) dan tidak terjadi segregasi. Namun demikian, untuk merealisasikan kelebihan tersebut diperlukan proses continuous backcrossing selama 6-10 generasi.

Pada populasi F2 Backcross, hanya ada dua macam kemungkinan genotipe yaitu: heterosigot/Ht (Aa) yang dalam ilustrasi pada Gbr. 1 dan Gbr. 2 akan diberi kode tipe “H” atau homosigot/hm (aa) atau tipe “B.” Simbol B, atau H merupakan simbol pengganti genotipe untuk masing-masing individu BC1, yang akan digunakan dalam analisis linkage atau dalam pembuatan linkage map. Ratio antara genotipe tipe “B” atau “H” pada populasi BC1 adalah 1:1

Pada populasi NIL, hanya dijumpai ada satu macam genotipe untuk sebagian besar lokus yang ada di dalam genom, yaitu: Hm (AA) yang dalam ilustrasi pada Gbr. 3 dan Gbr. 4 akan diberi kode tipe “A” dan homosigot (aa) atau tipe “B.” Pada sebagian kecil lokus-lokus  target, akibat dilakukan selfing pada lokus yang heterosigot, maka akan dijumpai segregasi menjadi genotipe Hm (AA) atau tipe “A”, hm (aa) atau tipe “B” dan Ht (Aa) atau tipe “H”. Simbol A, B dan H merupakan simbol pengganti genotipe untuk masing-masing individu dalam populasi NIL, yang akan digunakan dalam analisis linkage atau dalam pembuatan linkage map. Pada populasi NIL, lokus-lokus yang masih bersegregasi merupakan lokus-lokus target yang kemungkinan besar linkage dengan karakter tertentu yang akan di-petakan karena pada lokus lain yang tidak linkage dengan lokus-lokus target akan ada dalam kondisi isogenic (kondisi homosigot).

Jika setiap individu dalam Mapping Population F2 Backcross dianalisis dengan menggunakan marker yang dominan (seperti marker RAPD, AFLP, atau ISSR), maka individu dengan skor (+) merupakan individu dengan genotipe heterosigot Ht (Aa atau tipe “H”) dan yang mempunyai skor (-) merupakan individu dengan genotipe hm (aa atau tipe “B”). Untuk populasi BC1 atau TC1 maka ratio antara Aa atau tipe “H” dengan aa atau tipe “B” akan 1:1.

Jika Mapping Population-nya adalah NIL, maka untuk sebagian besar lokus-lokus yang dianalisis kemungkinannya akan mempunyai genotipe Hm (AA) atau hm (aa). Untuk sebagian kecil lokus yang dianalisis yang ada dalam kondisi heterosigot Aa, setelah selfing akan bersegregasi menjadi AA, aa, dan Aa, sehingga kalau dianalisis dengan marker dominan maka individu yang mempunyai skor (+) bisa mempunyai genotipe Hm (AA) atau tipe “A,” atau Ht (Aa) atau tipe “H” (untuk ilustrasi Gbr. 3 atau Gbr. 4). Sebaliknya, individu yang mempunyai skor (-), genotipenya hm (aa) atau tipe B (Gbr. 3 dan Gbr. 4). Dengan demikian, jika digunakan marker yang sifatnya dominan, tetap tidak akan dapat membedakan genotipe individu dengan skor (+) sebagai AA (tipe “A”) atau Aa (tipe “H”) dan hanya bisa mengidentifikasi individu dengan skor (-) sebagai aa atau tipe “B.”

Jika marker molekuler yang digunakan untuk analisis individu-individu tanaman dalam populasi F2 backcross atau populasi NIL adalam marker yang bersifat co-dominan (marker SSR atau marker SSCP), maka tidak akan muncul potensi masalah sebagaimana yang dijelaskan dalam uraian sebelumnya. Individu dengan genotipe Hm (AA) atau tipe “A” akan dapat dengan mudah dibedakan dari genotipe Ht (Aa) atau tipe “H.” dan dari individu dengan genotipe hm (aa) atau tipe “B.”

Dari penjelasan di atas dapat ditarik kesimpulan bahwa: Mapping Population F2 backcross dan NIL hanya memerlukan 90-100 individu untuk keperluan analisis linkage. Walaupun Mapping Population F2 backcross memerlukan dua tahap controlled polination, tetapi karena haya ada dua kelas genotipe (tipe “H” dan tipe “B”) maka individu dengan skor (+) dapat diketahui identitas genotipenya menggunakan marker dominan. Sebaliknya Mapping Population NIL lebih kompleks penyiapannya, tetapi mampu membuat populasi tanaman yang isogenik untuk mayoritas lokus yang ada dalam genom tanamannya. Lokus yang masih bersegregasi merupakan lokus target, kemungkinan besar sebagai lokus yang dicari dalam penelitian (misalnya lokus yang linkage dengan karakteristik fenotipik tertentu). Populasi mana yang akan dibuat untuk mendukung pelaksanaan penelitian analisis linkage sangat tergantung pada pilihan peneliti dan sumberdaya yang tersedia.

Semoga ulasan dari beberapa pertanyaan yang sering mengemuka dalam diskusi di kelas atau ketika membaca thesis/disertasi mahasiswa SPS IPB tersebut ada manfaatnya. Semoga juga dapat menjadi sepotong kecil ‘gading atau belang yang dapat ditinggalkan bagi kolega yang membacanya. Feedback dan masukan dari teman-teman sangat diharapkan untuk meningkatkan pemahaman bersama, silakan berikan feedback dan masukan di kolom komentar.

Baca juga (Read also):

About PMB Lab: Prof. Sudarsono

This blog is dedicated as a communication media among alumni associated with PMB Lab, Dept. of Agronomy and Horticulture, Fac. of Agriculture, IPB, Bogor – Indonesia. It contains various information related to alumni activities, PMB Lab’s on going activities and other related matters.
This entry was posted in Kuliah (Courses), Q & A and tagged , , , , , . Bookmark the permalink.

One Response to Q&A in AGH635 Course: Mapping Population Part 3 – F2 Backcross dan Populasi yang Terkait

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s