Q&A in AGH635 Course: Mapping Population Part 4 – Pseudo-Test Cross (Populasi F1 yang Diasumsikan sebagai Populasi BC1)

Cacao

Gbr. 1. Pembuatan Mapping Population pada tanaman kakao menghadapi kendala lamanya periode juvenil. Pada kakao, daya hasil buah (bijinya) mulai stabil setelah antara 5-7 tahun sejak ditanam di lapangan.

Pada tanaman setahun, pertumbuhan tanaman dari sejak perkecambahan, periode siklus pertumbuhan vegetatif, hingga siklus generatifnya relatif pendek (misalnya antara 4-6 bulan). Pembuatan berbagai macam tipe mapping population relatif mudah untuk dilakukan. Tetua P1 dan P2 yang homosigot dapat dihasilkan dalam waktu 1-3 tahun. Dengan demikian pembuatan populasi F2 intercross, F2 backcross, NIL, atau RIL tidak akan memerlukan waktu lama untuk mendapatkannya.

Sebaliknya, pada tanaman tahunan – siklus pertumbuhan dari sejak perkecambahan sampai dengan berbuah stabil dapat mencapai 5-7 tahun di lapangan (tergantung pada spesies tanamannya). Pada tanaman tahunan, pembuatan mapping population menjadi relatif sulit dilakukan karena akan memerlukan waktu yang sangat lama. Pada beberapa tanaman tahunan seperti kakao, karet, kelapa, kelapa sawit, dan kopi – membuat tanaman dalam kondisi homosigot melalui selfing akan memerlukan waktu yang sangat panjang.

Sebagai contoh: untuk membuat populasi F2-intercross pada tanaman kelapa, memerlukan waktu paling sedikit 20-30 tahun (terutama jika diinginkan untuk mempelajari karakter daya hasilnya). Demikian juga untuk membuat populasi F2-backcross, juga memerlukan waktu paling sedikit 20-30 tahun. Membuat populasi NIL atau RIL jelas lebih tidak memungkinkan lagi karena akan memerlukan waktu yang sangat panjang.

Dalam hal ini, pekerjaan harus dimulai oleh peneliti dari generasi saat ini dan secara bertahap dilanjutkan oleh generasi berikutnya (karena peneliti yang memulai kegiatan telah pensiun dan peneliti berikutnya yang harus melanjutkan kegiatannya!). Secara teknis hal ini sulit dilakukan mengingat regenerasi peneliti di Indonesia yang mau menekuni satu bidang tertentu secara terus-menerus lintas generasi relatif sulit.

Pseudo-testcross

Gbr. 2. Skenario pembuatan mapping population Pseudo-testcross dengan menggunakan tetua P1 yang heterozygous dan tetua P2 yang homozygous resesif untuk menghasilkan populasi F1 yang setara dengan populasi F2 backcross.

Pertanyaannya, lantas bagaimana jika kita ingin melakukan analisis linkage pada tanaman tahunan? Apakah ada alternatif populasi selain F2 intercross atau F2 backcross? Jawabannya ADA! yaitu penggunaan populasi PSEUDO-TESTCROSS. Dalam populasi pseudo-testcross, tetua P1 (dengan lokus yang alel-alelnya diasumsikan dalam kondisi heterosigot) disilangkan dengan tetua P2 (dengan lokus yang alel-alelnya diasumsikan dalam kondisi homosigot resesif) sehingga dihasilkan populasi F1 sebanyak 100 individu. Populasi F1 hasil persilangan P1 x P2 tersebut dapat dianggap setara dengan populasi F2-backcross, yang artinya: segregasi pada populasi F1 setara dengan segregasi pada populasi F2-backcross.

F2 Backcross

Gbr. 3. Proses pembuatan Mapping Population F2 Backcross dari tetua yang homosigot. Sebagai ilustrasi, tetua P1 (donor sifat resisten yang akan dipelajari) dan P2 sebagai tetua rentan.

Walaupun populasi sebetulnya adalah F1, tetapi dengan asumsi bahwa P1 mempunyai genotipe heterosigot dan tetua P2 bergenotipe homosigot resesif, maka populasi F1-nya mempunyai pola segregasi yang sama dengan pola segregasi populasi F2-backcross atau test cross. Oleh karena itu, populasi tersebut dikenal sebagai populasi Pseudo-Testcross – yang dapat digunakan sebagai mapping population dalam analisis linkage. Populasi pseudo-testcross banyak digunakan sebagai alternatif mapping population untuk mempelajari analisis linkage pada tanaman tahunan, yang heterosigositas alel dalam lokus-lokusnya tinggi dan umur berbunga pertama kalinya panjang (7-10 tahun baru stabil berproduksi).

Dalam prakteknya, tetua P1 yang digunakan bisa sembarang tanaman yang mempunyai karakter fenotipik unggul tertentu (misalnya: tanaman yang resisten, toleran terhadap cekaman, berdaya hasil tinggi, atau kualitas produk yang bagus). Jika ingin memastikan bahwa tanaman tetua P1 yang digunakan mempunyai tingkat heterosigositas tinggi maka yang digunakan sebagai tetua P1 dapat berupa individu F1 dari berbagai klon-klon terpilih yang telah dilepas (telah di-released) sebagai kultivar unggul. Tentu saja individu F1 terpilih harus yang mempunyai sifat-sifat unggul sebagaimana disebutkan di atas.

Tetua P2 yang digunakan diharapkan mempunyai lokus yang sebanyak mungkin alelnya berupa: (1) “null allele” (tidak ada produk amplifikasi atau mempunyai skor [-] jika marker yang digunakan adalah marker dominan atau (2) mempunyai alel homosigot untuk salah satu alel dari tetua P1-nya (i.e. jika P1 alelnya 12, P2-nya 11 atau 22) atau mempunyai pasangan alel yang sama sekali berbeda dengan tetua P1-nya (i.e. jika P1 alelnya 12, P2-nya 33, 34 atau pasangan alel lainnya yang bukan 12 – pada setiap lokus yang dianalisis), jika marker yang digunakan adalah marker ko-dominan.

Dalam populasi pseudo-testcross, hanya diperlukan sebanyak 90-100 individu tanaman F1, seperti pada populasi F2-backcross (ini merupakan poin positif dari pseudo-testcross). Populasi pseudo-testcross dapat dihasilkan hanya dengan satu kali persilangan terkontrol saja (poin positif dari pseudo-testcross).

Karena heterosigositas tetua P1 dan P2 umumnya tidak diketahui, agar dapat digunakan dalam analisis linkage maka pada populasi F1 – masing-masing lokusnya harus bersegregasi 1 : 1 untuk skor (+) : skor (-). Jika segregasinya tidak 1:1 maka lokus yang bersangkutan tidak dapat digunakan atau harus dikeluarkan datanya dari data set untuk analisis linkage. Karena segregasi 1:1 yang demikian itu hanya dihasilkan jika tetua P1-nya heterosigot dan tetua P2-nya homosigot untuk masing-masing lokus, maka segregasi 1:1 pada populasi F1 dapat digunakan sebagai penduga genotipe tetua P1 dan P2-nya.

Untuk itu, tahapan kegiatan yang perlu dilakukan antara lain :

  1. Skoring marker molekuler pada tetua P1 dan P2 untuk mengidentifikasi lokus-lokus yang mempunyai marker yang P1-specific (muncul/skor [+] pada tetua P1 dan tidak muncul/skor [-] pada tetua P2) serta yang P2-specific (muncul/skor [+] pada tetua P2 dan tidak muncul/skor [-] pada tetua P1).
  2. Skoring marker molekuler pada populasi F1 untuk lokus-lokus yang diketahui sebagai P1 specific (karena P1 adalah donor sifat tertentu yang dievaluai). Setelah skoring, dilanjutkan dengan analisis segregasi untuk menentukan lokus-lokus yang segregasinya 1 : 1 untuk skor (+) : skor (-) menggunakan model genetik Mendel dan uji Chi-square.
  3. Memilih lokus-lokus yang dapat digunakan dalam analisis linkage dan membuang lokus-lokus yang tidak dapat digunakan. Hanya lokus yang segregasinya 1 : 1 untuk skor (+) : skor (-) pada populasi F1 yang dapat dipilih dan digunakan untuk tahahan berikutnya. Jika lokusnya tidak bersegregasi 1:1 untuk skor (+) : skor (-) pada populasi F1 maka lokus yang bersangkutan tidak dapat digunakan dalam analisis linkage (ini merupakan point negatif Pseudo-testcross).
  4. Melakukan analisis linkage untuk lokus-lokus yang bersegregasi 1:1 pada populasi F1. Pengelompokkan lokus-lokus yang bersegregasi 1:1 ke dalam linkage group tertentu dilakukan dengan bantuan perangkat lunak dan komputer.

Berikut disajikan contoh data pada tetua P1, tetua P2, dan populasi F1 yang dihasilkan dengan menggunakan populasi Pseudo-testcross dan bisa tidaknya lokus yang dicontohkan untuk digunakan dalam analisis linkage:

Tabel 1: Contoh Data – RAPD Marker (yang juga berlaku untuk marker dominan lainnya seperti ISSR dan AFLP).

No. Skor P1  Skor P2  Segregasi skor(+):skor(-) pd. F1  Keterangan

  1.         +             –          P1-specific: (+):(-)=1:1                                 OK
  2.         +             –          P1-specific: (+):(-)=3:1                                 NO
  3.         +             –          P1-specific: (+):(-)=15:1                               NO
  4.         +            +          100% skor (+)                                                NO
  5.         –              –          100% skor (-)                                                NO
  6.         –             +          P2-specific: (-):(+)=1:1                                 OK
  7.         –             +          P2-specific: (-):(+)=1:3                                 NO
  8.         –             +          P2-specific: (-):(+)=1:15                               NO

Dari Tabel 1 di atas, Data No. 1-3 dan 6-8 merupakan data marker yang polimorfik sedangkan data No. 4-5 merupakan data marker yang monomorfik. Data No. 1-3 merupakan marker yang P1 specific (muncul pada tetua P1 dan tidak muncul pada tetua P2) sedangkan No. 6-8 merupakan marker yang P2 specific (muncul pada tetua P2 dan tidak muncul pada tetua P1).

Dari data marker yang P1 specific. Marker No. 1 bersegregasi 1:1 untuk skor (+) : skor (-), sedangkan No. 2 dan 3 masing-masing bersegregasi 3:1 dan 15:1. Sebaliknya, dari data marker No. yang P2 specific. Marker No. 6 bersegregasi 1:1 untuk skor (-) : skor (+), sedangkan No. 7 dan 8 masing-masing bersegregasi 1:3 dan 1:15.

Berdasarkan berbagai hal tersebut di atas, maka: (1) Lokus marker No. 1 dapat digunakan dalam analisis linkage untuk genom tetua P1 (karena markernya polimorfik, P1 specific, dan bersegregasi 1:1 pada populasi F1), (2) Marker No. 6 dapat digunakan dalam analisis linkage genom tetua P2 (karena markernya polimorfik, P2 specific, dan bersegregasi 1:1 pada populasi F1), (3) Marker No. 2 dan 3 serta No. 7 dan 8 – tidak dapat digunakan untuk analisis linkage genom tetua P1 atau tetua P2 meskipun merupakan marker yang polimorfik dan P1 atau P2 – specific, karena segregasinya tidak 1:1 (tidak memenuhi pola segregasi untuk model populasi back-cross), (4) Marker No. 4 dan 5 merupakan lokus yang monomorfik sehingga tidak dapat digunakan dalam analisis linkage.

Tabel 2: Contoh Data – SSR Marker (yang juga berlaku untuk marker co-dominan lainnya seperti SSCP dan SCAR markers).

No.   Skor P1  Skor P2  Segregasi pasangan alel pd. F1  Keterangan

  1.        12            11        P1 specific (12):(11)=1:1                          OK
  2.        12            22        P1 specific (12):(22)=1:1                         OK
  3.        12            34        P1 specific (1-):(2-)=1:1                          OK
  4.        11             11        Monomorphic                                           NO
  5.        12            12        Segregasi (11):(12):(22)=1:2:1               NO
  6.        22            22       Monomorphic                                            NO
  7.        11             12       P2 specific (11):(12)=1:1                          OK
  8.        22            12        P2 specific (22):(12)=1:1                         OK
  9.        34            12        P2 specific (1-):(2-)=1:1                          OK

Dari Tabel 2 di atas, Data No. 1-3 dan 7-9 merupakan data marker yang polimorfik sedangkan data No. 4 dan No. 6 merupakan data marker yang monomorfik. Data No. 5 – lokus kedua tetuanya heterosigot, sehingga mengikuti model F2 intercross. Berdasarkan data, marker No. 1-3 merupakan marker yang P1 specific (muncul heterosigot pada tetua P1 dan homosigot pada tetua P2; kecuali No. 3 – yang alelnya sama sekali berbeda dengan tetua P1-nya) sedangkan No. 7-9 merupakan marker yang P2 specific (muncul heterosigot pada tetua P2 dan homosigot pada tetua P1; kecuali No. 9 – yang alelnya sama sekali berbeda dengan tetua P2-nya).

Pada data No. 1-2 yang P1 specific, populasi F1-nya bersegregasi 1:1 untuk masing-masing genotipe. Dari data No. 7-8 yang P2 specific, pada populasi F1-nya juga bersegregasi 1:1 untuk masing-masing genotipe. Sedangkan untuk data No. 3 dan No. 9, segregasi genotipe (1- [13 dan 14]) : (2- [23 dan 24])=1:1.

Berdasarkan berbagai hal tersebut di atas, maka: (1) lokus No. 1 -3 dapat digunakan untuk analisis linkage antar marker dari genom tetua P1 (karena markernya polimorfik, P1 specific, dan genotipenya bersegregasi 1:1 pada populasi F1), (2) lokus No. 7-9 dapat digunakan untuk analisis linkage genom tetua P2 (karena markernya polimorfik, P2 specific, dan genotipenya bersegregasi 1:1 pada populasi F1), (3) Lokus No. 5 – tidak dapat digunakan untuk analisis linkage genom tetua P1 atau tetua P2 segregasi genotipenya tidak 1:1 pada populasi F1, (4) Lokus No. 4 dan 6 merupakan lokus yang monomorfik sehingga tidak dapat digunakan dalam analisis linkage.

Dari semua penjelasan di atas dapat ditarik kesimpulan bahwa: Pseudo-testcross dapat digunakan sebagai alternatif mapping population pada tanaman tahunan. Kelebihan populasi Pseudo-testcross antara lain:

  1. Dapat digunakan sekaligus untuk memetakan genom tetua P1 ataupun genom tetua P2 dengan menggunakan satu mapping population,
  2. Cukup melakukan satu kali persilangan terkontrol untuk memproduksi populasi F1 yang setara dengan dan diasumsikan sebagai populasi F2-backcross, dan
  3. Hanya memerlukan antara 90-100 individu untuk membuat mapping population

Adapun kekurangan populasi Pseudo-testcross antara lain:

  1. Tidak semua lokus yang polimorfik dapat digunakan dalam linkage analysis,
  2. Hanya lokus yang bersegregasi 1:1 pada populasi F1 yang dapat digunakan dalam linkage analysis, dan
  3. Jika linkage analysis ditargetkan pada tetua tertentu (misalnya analisis untuk genom P1) maka tidak semua lokus yang bersegregasi 1:1 dapat digunakan untuk analisis linkage (hanya yang P1 specific saja karena targetnya menganalisis genom P1).

Semoga ulasan dari beberapa pertanyaan yang sering mengemuka dalam diskusi di kelas atau ketika membaca thesis/disertasi mahasiswa SPS IPB tersebut ada manfaatnya. Semoga juga dapat menjadi sepotong kecil ‘gading atau belang yang dapat ditinggalkan bagi kolega yang membacanya. Feedback dan masukan dari teman-teman sangat diharapkan untuk meningkatkan pemahaman bersama, silakan berikan feedback dan masukan di kolom komentar.

Baca juga (Read also):

About PMB Lab: Prof. Sudarsono

This blog is dedicated as a communication media among alumni associated with PMB Lab, Dept. of Agronomy and Horticulture, Fac. of Agriculture, IPB, Bogor – Indonesia. It contains various information related to alumni activities, PMB Lab’s on going activities and other related matters.
This entry was posted in Kuliah (Courses), Q & A and tagged , , , , , . Bookmark the permalink.

One Response to Q&A in AGH635 Course: Mapping Population Part 4 – Pseudo-Test Cross (Populasi F1 yang Diasumsikan sebagai Populasi BC1)

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s