Q&A in AGH635 Course: Mapping Population Part 5 – Bulk Segregant Analysis (BSA)

Dalam postingan sebelumnya (Q and A: Mapping Population Part 3 – F2 Backcross dan-populasi-yang-terkait), telah dibahas dan didiskusikan masalah populasi Near Isogenic Line (NIL), yang dapat digunakan sebagai Mapping Population. Populasi NIL sangat cocok untuk mengevaluasi dan menentukan marker yang berasosiasi (linked) dengan karakter fenotipik tertentu yang dijadikan target.

Dalam penjelasan sebelumnya telah diuraikan bahwa individu-individu dalam populasi NIL mempunyai genom yang isogenik (hampir sama genomnya), kecuali untuk sejumlah bagian genom tertentu saja yang masih bersegregasi (berbeda konstitusi genetiknya [beda genotipenya]) jika dibandingkan antar individu dalam populasi (oleh karena itu disebut dengan istilah: NEAR ISOGENIC). Pada bagian genom yang masih bersegregasi tersebut terdapat marker molekuler yang juga bersegregasi (misalnya: dalam hal marker yang dominan – bersegregasi untuk skor [+] dan [-] atau dalam hal marker yang kodominan – bersegregasi untuk alternatif alel yang ada pada lokusnya [i.e.: 11, 12, dan 22]) dan terdapat karakter tertentu yang juga bersegregasi (misalnya: resisten [RR dan Rr] atau rentan [rr]).

Mempelajari kosegregasi antara sejumlah kecil lokus-lokus marker yang alelnya masih bersegregasi dengan fenotipe target yang juga bersegregasi, tentu relatif lebih mudah jika dibandingkan dengan mempelajari ko-segregasi seluruh lokus di dalam genom tanaman target dengan fenotipe yang sama. Itulah salah satu kelebihan dari populasi NIL dibandingkan mapping population lain dalam kaitannya dengan linkage analysis. Namun demikian, untuk mendapatkan kondisi near-isogenik diperlukan tahapan backcrossing selama beberapa generasi (6-10 generasi backcrossing). Dengan demikian, menghasilkan populasi NIL – selain memerlukan waktu yang lama juga memerlukan resource yang tidak sedikit.

Pertanyaannya, lantas bagaimana jika kita ingin menggunakan Populasi NIL tetapi tidak mempunyai waktu dan resources yang diperlukan untuk melakukan 6-10 generasi backcrossing? Apakah ada alternatif cara untuk menghasilkan populasi NIL tanpa harus melakukan backcrossing selama beberapa generasi? Jawabannya ADA! yaitu menggunakan pendekatan BULK SEGREGANT ANALYSIS (BSA). Dalam BSA, kita bisa mendapatkan kondisi yang setara dengan near-isogenic sebagaimana yang didapat pada populasi NIL tetapi cukup dengan menggunakan populasi F2-intercross (satu kali persilangan terkontrol untuk memproduksi F1 dan satu generasi selfing untuk menghasilkan F2).

Dalam prakteknya, tahapan kegiatan yang dilakukan antara lain adalah sebagai berikut:

  • Setelah menghasilkan populasi bersegregasi F2 turunan hasil persilangan dari dua tetua terpilih (tetua P1 x P2), individu-individunya ditanam di lokasi tempat pengamatan fenotipe targetnya (misalnya: di umah kaca untuk ketahanan penyakit atau di lapangan untuk daya hasil). Sampel daun dipanen pada umur yang sesuai (misalnya: daun muda) dari masing-masing individu tanaman F2, sebelum tanamannya diinokulasi dengan penyakit atau hasilnya dipanen. Jaringan daun yang dipanen dapat disimpan segar atau kering dalam kondisi beku, atau dapat langsung diisolasi DNA-nya dan DNA-nya disimpan dalam kondisi beku.
  • Setelah evaluasi resistensi terhadap penyakit atau penentuan daya hasil untuk masing-masing individu tanaman telah dilakukan, selanjutnya  hasil pengamatan digunakan untuk mengelompokkan setiap individu dalam populasi ke dalam kelompok resistensi atau daya hasil tertentu. Sebagai contoh untuk resistensi misalnya dikelompokkan menjadi: Klp I-sangat resisten, II-resisten, III-agak resisten, IV. agak rentan, V-rentan, dan VI-sangat rentan. Sedangkan sebagai contoh untuk daya hasil misalnya menjadi: Klp I-sangat tinggi, II-tinggi, III-agak tinggi, IV. agak rendah, V-rendah, dan VI-sangat rendah.
  • Setelah pengelompokan berdasarkan fenotipe dilakukan – dipilih dua kelompok yang fenotipenya paling ekstrim, misalnya: dipilih individu-individu dari klp I (sangat resisten atau hasilnya sangat tinggi) versus klp VI (sangat rentan atau hasilnya sangat rendah). DNA setiap individu dari masing-masing kelompok dicampurkan menjadi satu dan diberi label sebagai POOL I (DNA dari semua tanaman yang sangat resisten atau daya hasil sangat tinggi) dan POOL II (DNA dari semua tanaman yang sangat rentan atau daya hasil sangat rendah). Biasanya, setiap POOL DNA dibatasi terdiri atas maksimum 10 individu. Dalam hal ini dapat dibuat lebih dari satu campuran DNA POOL I dan atau POOL II, jika individu yang tergolong ke dalam masing-masing kelompok lebih dari 10 individu. Misalnya, karena yang tergolong sebagai sangat resisten ada 20 tanaman, maka dibuat campuran DNA POOL I-1 dari 10 individu dan DNA POOL I-2 dari 10 individu sisanya.
  • Dua POOL DNA yang mempunyai fenotipe kontras tersebut (sangat resisten versus sangat rentan atau sangat tinggi versus sangat rendah daya hasilnya) merupakan representasi dua lini yang near isogenic (konstitusi alelik genotipenya sama) untuk hampir semua lokus, tetapi bersegregasi (berbeda konstitusi alelik pada lokus tertentu), yaitu: untuk lokus-lokus pengendali fenotipe target dan lokus-lokus marka molekuler yang kemungkinan linkage dengan gen pengendali fenotipe. Alel-alel dari ke dua kelompok lokus (lokus untuk sifat resistensi atau hasil tinggi dan berbagai lokus marker molekuler yang linkage dengan sifat resistensi atau daya hasil) tersebut masih bersegregasi untuk POOL DNA I dan POLL DNA II.
  • POOL DNA yang didapat tersebut digunakan sebagai templat (cetakan) untuk menghasilkan profil alelik dari marker molekuler, misalnya: marker RAPD, ISSR, AFLP, SSR, SNAP atau SSCP. Profil marker molekuler yang didapatkan dari penggunaan POOL DNA I (sangat resisten atau daya hasil sangat tinggi) dikontraskan dengan marker molekuler yang didapatkan dari penggunaan POOL DNA II (sangat rentan atau daya hasil sangat rendah).
  • Hasil analisis profil marker (sebagai contoh dipilih marker RAPD) yang diperoleh kemungkinannya adalah sebagai berikut (Tabel 1): skor untuk lokus marker (a) M1 – POOL I (+) vs. POOL II (-), (b) M4 – POOL I (+) vs. POOL II (+), (c) M7 – POOL I (-) vs. POOL II (+), dan (d) M10 – POOL I (-) vs. POOL II (-).

BSA 1

  • Dari empat kemungkinan profil marker yang telah dianalisis (lihat Tabel 1) tersebut dapat diambil simpulan: Kelompok lokus dengan (1) Profil marker (d) tidak ada manfaatnya karena markernya  mempunyai skor (-) pada dua POOL DNA (POOL DNA I vs. POOL DNA II=[-] vs. [-]); (2) Profil marker (c) tidak ada manfaatnya karena markernya mempunyai skor (+) pada POOL DNA II (marker yang POOL DNA II specific [spesifik pada tanaman rentan atau daya hasil rendah]), padahal yang diinginkan adalah marker yang skor (+) untuk POOL DNA I (marker yang POOL DNA I specific – pool dari individu resisten atau daya hasil tinggi); (3) Profil marker (b) tidak diinginkan karena isogenik untuk POOL DNA I dan POOL DNA II; dan (4) Profil marker (a) saja yang merupakan kelompok lokus yang dicari dalam kegiatan seperti ini. Lokus ini merupakan POOL DNA I specific marker (hanya muncul pada POOL DNA I dari tanaman yang resisten atau berdaya hasil tinggi dan tidak muncul pada POOL DNA II dari tanaman sangat rentan atau berdaya hasil rendah). Harus diingat bahwa POOL DNA I specific marker adalah marker yang skor-nya (+) untuk pool DNA dari tanaman yang sangat resisten. Diantara lokus marker dengan profil marker (a) tersebut diduga ada yang linkage (terkait) dengan karakter resisten atau daya hasil tinggi tetapi ada juga yang independent segregation. Ini yang akan dievaluasi pada tahapan berikutnya.
  • Semua lokus yang mempunyai profil marker POOL DNA I specific (profil marker [a]) merupakan kandidat marker yang terkait dengan sifat ketahanan atau QTL daya hasil tinggi. Sebaliknya, lokus dengan profil marker (b), (c) dan (d) tidak akan dievaluasi lebih lanjut. Selanjutnya, marker yang POOL DNA I specific (profil marker [a]) dievaluasi segregasi alelnya dengan menggunakan DNA individu tanaman F2 yang telah diketahui identitas fenotipenya (misalnya telah diketahui fenotipenya sebagai sangat resisten, sangat rentan, dan kelompok resistensi lainnya atau hasil sangat tinggi, sangat rendah atau kelompok hasil lainnya). Kemungkinan hasil pengujian yang didapat antara lain sebagai berikut:

BSA 2Dari berbagai tipe lokus yang dijadikan contoh di atas (Tabel 2), dapat diinterpretasikan sebagai berikut:

  • Tipe lokus marker d: tidak ada artinya dalam kaitannya dengan mencari marker yang linkage (terkait) dengan fenotipe resisten atau daya hasil tinggi. Tipe lokus marker d mempunyai skor (-) untuk tanaman yang sangat resisten/resisten atau daya hasil sangat tinggi dan tinggi sehingga marker tipe d kemungkinan tidak linkage (terkait) dengan fenotipe target.
  • Tipe lokus marker c: tidak ada artinya dalam kaitannya dengan mencari marker yang linkage (terkait) dengan fenotipe sifat resisten atau daya hasil tinggi. Tipe lokus marker c mempunyai skor (+) untuk tanaman yang sangat resisten/resisten hingga yang rentan/sangat rentan sehingga marker tipe c kemungkinan tidak linkage (terkait) dengan fenotipe target.
  • Tipe lokus marker b: besar kemungkinan merupakan marker yang linkage (terkait) dengan fenotipe sifat resisten atau daya hasil tinggi. Tipe lokus marker b mempunyai skor (+) untuk tanaman yang sangat resisten/resisten sehingga sesuai yang diharapkan berpotensi linkage (terkait) dengan fenotipe target. Tetapi, marker tipe b juga skor (+) atau muncul pada kelompok tanaman yang agak rentan tetapi tidak muncul pada kelompok tanaman yang sangat rentan. Hal ini dapat dijelaskan bahwa kemungkinan tanaman-tanaman yang agak rentan tersebut ada dalam kondisi heterosigot. Sebagai akibat genotipe yang heterosigot tersebut, tanamannya mempunyai skor (+) untuk marker karena RAPD merupakan marker dominan.
  • Tipe lokus marker a: besar kemungkinan merupakan marker yang linkage (terkait) dengan fenotipe sifat resisten atau daya hasil tinggi. Tipe lokus marker a mempunyai skor (+) hanya untuk tanaman yang sangat resisten/resisten sehingga sesuai yang diharapkan berpotensi linkage (terkait) dengan fenotipe target. Setelah mendapatkan Tipe Lokus Marker a, maka kelompok lokus marker seperti ini dapat dievaluasi lebih lanjut dalam hubungannya dengan mencari lokus marker yang linkage (terkait) dengan gen pengendali fenotipe tertentu.

Sebagai kesimpulan, Bulk Segregant Analysis (BSA) pada prinsipnya menggunakan prosedur bertahap dengan (1) mengevaluasi marker molekuler menggunakan POOL DNA (I dan II) yang diisolasi dari tanaman dengan fenotipe kontras (Resisten vs. rentan; high yielding vs. low yielding, dsb.)untuk menciptakan kondisi isogenic sekaligus mempertahankan beberapa bagian dari genom tetap bersegregasi, (2) mengidentifikasi marker yang bersegregasi (posisinya ada pada bagian genom yang masih bersegregasi) untuk POOL DNA I dan POOL DNA II, (3) menguji lokus marker yang bersegregasi untuk POOL DNA I dan POOL DNA II pada individu tanaman yang berbeda sangat kontras fenotipenya, dan (4) memastikan ada tidaknya keterkaitan antara lokus marker terpilih (point 3) dengan fenotipe target melalui analisis ko-segregasi untuk setiap individu pada populasi F2. Catatan terakhir untuk BSA, individu terpilih yang dijadikan sebagai POOL DNA I dan POOL DNA II harus merupakan bagian dari populasi yang diturun dari tetua yang sama (common by descend).

Semoga ulasan dari beberapa pertanyaan yang sering mengemuka dalam diskusi di kelas atau ketika membaca thesis/disertasi mahasiswa SPS IPB tersebut ada manfaatnya. Semoga juga dapat menjadi sepotong kecil ‘gading atau belang yang dapat ditinggalkan bagi kolega yang membacanya. Feedback dan masukan dari teman-teman sangat diharapkan untuk meningkatkan pemahaman bersama, silakan berikan feedback dan masukan di kolom komentar.

Baca juga (Read also):

About PMB Lab: Prof. Sudarsono

This blog is dedicated as a communication media among alumni associated with PMB Lab, Dept. of Agronomy and Horticulture, Fac. of Agriculture, IPB, Bogor – Indonesia. It contains various information related to alumni activities, PMB Lab’s on going activities and other related matters.
This entry was posted in Kuliah (Courses), Q & A and tagged , , , , , . Bookmark the permalink.

One Response to Q&A in AGH635 Course: Mapping Population Part 5 – Bulk Segregant Analysis (BSA)

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s