Q & A : Kalau Ingin Mempelajari Ekspresi Gen, Bagaimana Cara atau Metode untuk Memonitor Terjadinya Ekspresi?

Tahapan ekspresi gen

Yang dimaksud dengan ekspresi gen adalah terjadinya proses (1) transkripsi DNA (gen) sehingga menghasilkan hnRNA, (2) RNA Processing sehingga menghasilkan mRNA, (3) Transfer mRNA dari inti ke sitoplasma, dan (4) Translasi mRNA sehingga menghasilkan polipeptida. Pada sejumlah gen tertentu, setelah translasi masih harus melalui proses "Protein Targetting" menuju ke organel, membran, atau bahkan keluar sel.

Karena kegiatan kuliah AGH634. Rekayasa Genetika Tanaman sedang berjalan, ada baiknya diulas (review) pertanyaan-pertanyaan dan diskusi yang berkembang di dalam kelas. Salah satunya adalah “Bagaimana cara atau metode untuk memonitor terjadi tidaknya ekspresi transgene?

Dalam konteks kuliah AGH634. Rekayasa Genetika Tanaman – cara atau metode untuk mengetahui terjadi tidaknya ekspresi transgene adalah dengan memonitor ada tidaknya produk yang terbentuk dari setiap tahapan ekspresi transgene (Gambar 1) dan kuantitasnya. Produk ekspresi yang dapat dimonitor keberadaan dan kuantitasnya yaitu: mRNA dan atau polipeptida yang terakumulasi.

Jika produk polipeptida yang akan dideteksi, maka metode yang dapat digunakan antara lain Western Blotting, ELISA atau metode imunologi lainnya. Jika produk mRNA yang akan dideteksi, maka metode yang dapat digunakan antara lain Northern Blotting, RT-PCR, dan qRT-PCR.

Deteksi polipeptida dengan Western Blotting dilakukan berdasarkan kemampuan spesifik antibodi untuk binding dengan antigen (protein targetnya). Meskipun polipeptida target yang akan dideteksi tercampur dengan ribuan polipeptida lainnya, antibodi hanya akan secara spesifik binding dengan protein target atau antigennya. Interaksi ini yang dijadikan sebagai dasar untuk melakukan deteksi ekspresi gen menggunakan metode Western Blotting.

Dalam pelaksanaannya, total protein yang dianalisis dipisahkan berdasarkan ukurannya (fraksionasi) dengan menggunakan vertical PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis). Deteksi akumulas polipeptida sebagai penduga ekspresi gen menggunakan Western Blotting bisa bersifat kualitatif (deteksi ada atau tidaknya ekspresi) atau kuantitatif (berapa banyaknya ekspresi).

Deteksi polipeptida dengan ELISA juga dilakukan berdasarkan kemampuan spesifik antibodi untuk binding dengan antigen (protein targetnya). Deteksi ekspresi menggunakan ELISA juga bisa bersifat kualitatif (deteksi ada atau tidaknya ekspresi) atau kuantitatif (berapa banyaknya ekspresi). Dalam pelaksanaannya, total protein yang dianalisis tidak perlu difraksionasi berdasarkan ukurannya menggunakan vertical PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis).

Deteksi mRNA dengan Northern Blotting dilakukan berdasarkan kemampuan spesifik antara mRNA untuk hibridisasi dengan pelacak DNA yang komplementer. Meskipun mRNA target yang akan dideteksi tercampur dengan ribuan mRNA lainnya, pelacak DNA yang digunakan hanya akan secara spesifik hibridisasi dengan mRNA target. Interaksi ini yang dijadikan sebagai dasar untuk melakukan deteksi ekspresi gen menggunakan metode Northern Blotting.

Dalam pelaksanaannya, total mRNA yang dianalisis dipisahkan berdasarkan ukurannya (fraksionasi) dengan menggunakan agarose gel electrophoresis khusus RNA. Deteksi akumulasi mRNA sebagai penduga ekspresi gen menggunakan Northern Blotting bisa bersifat kualitatif (deteksi ada atau tidaknya ekspresi) atau kuantitatif (berapa banyaknya ekspresi).

Deteksi keberadaan mRNA dengan RT-PCR, dilakukan berdasarkan kemampuan untuk mensintesis single strand cDNA dari total mRNA yang dianalisis dengan bantuan ensim reverse transcriptase (RT) dan mengamplifikasi spesifik cDNA menggunakan spesifik primer dan dibantu dengan ensim DNA polimerase (Taq). Meskipun mRNA target yang akan dideteksi tercampur dengan ribuan mRNA lainnya, pasangan primer yang digunakan hanya akan secara spesifik mengamplifikasi PCR  mRNA target. Interaksi ini yang dijadikan sebagai dasar untuk melakukan deteksi ekspresi gen menggunakan metode RT-PCR.

Dalam pelaksanaannya, pustaka single strand cDNA disintesis dari total mRNA. Pustaka cDNA yang didapat selanjutnya digunakan sebagai cetakan untuk PCR dengan sepasang primer spesifik. Produk PCR difraksionasi dengan agarose gel elektroforesis. Deteksi keberadaan specifk mRNA sebagai penduga ekspresi gen menggunakan RT-PCR bisa bersifat kualitatif (deteksi ada atau tidaknya ekspresi) atau semi kuantitatif (relative expression).

Prinsip deteksi dengan metode qRT-PCR – mirip dengan apa yang dilakukan oleh RT – PCR. Perbedaannya, produk PCR yang didapat tidak perlu difraksionasi dengan elektroforesis. Monitoring proses amplifikasi dilakukan secara real time dan ada tidaknya produk amplifikasi tidak perlu dielektroforesis. Deteksi keberadaan specifk mRNA sebagai penduga ekspresi gen menggunakan qRT-PCR bisa bersifat kualitatif (deteksi ada atau tidaknya ekspresi) atau semi kuantitatif (relative expression).

Dalam pelaksanaannya, pustaka single strand cDNA disintesis dari total mRNA. Pustaka cDNA yang didapat selanjutnya digunakan sebagai cetakan untuk qPCR dengan sepasang primer spesifik. Produk amplifikasi PCR dimonitor real time dan diperbandingkan dengan internal kontrol.

Demikianlah sedikit penjelasan tentang bagaimana metode untuk mendeteksi ekspresi transgene dalam rekayasa genetika tanaman. Semoga sedikit penjelasan yang diuraikan diatas dapat membantu menambah pemahaman bagi kolega yang membacanya. Semoga juga dapat menjadi sepotong kecil ‘gading atau belang yang dapat ditinggalkan bagi rekan sejawat sekalian. Feedback dan masukan dari teman-teman sangat diharapkan untuk meningkatkan pemahaman bersama, silakan berikan feedback dan masukan di kolom komentar.

Related articles

About PMB Lab: Prof. Sudarsono

This blog is dedicated as a communication media among alumni associated with PMB Lab, Dept. of Agronomy and Horticulture, Fac. of Agriculture, IPB, Bogor – Indonesia. It contains various information related to alumni activities, PMB Lab’s on going activities and other related matters.
This entry was posted in Kuliah (Courses), Q & A, Serbaneka Info and tagged , , , , , , . Bookmark the permalink.

2 Responses to Q & A : Kalau Ingin Mempelajari Ekspresi Gen, Bagaimana Cara atau Metode untuk Memonitor Terjadinya Ekspresi?

  1. Seagames says:

    Pada beberapa publikasi dalam studi ekpresi mengguakan RT-PCR atau Q-PCR sebagai standart ekpresi menggunakan gen actin atau 18 sRNA ribosomal,
    pertayaan saya kenapa kita harus menggunakan standart menggunakan actin atau 18s RNA ribosomal dan apa hubungan antara standart tersebut dengan ekspresi gen target kita?
    Trimakasih

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s