Q&A in AGH634 Course: Aneka Pertanyaan tentang Real Time PCR # 3

Salah satu mahasiswa pascasarjana yang pernah mengambil kuliah AGH635. Tenik Molekuler Seluler dalam Pemuliaan Tanaman bertanya pada saya tentang hasil analisis UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography). Masalah yang dipertanyakan adalah sebagai berikut:

  • Saya memakai UPLC untuk mempelajari ekspresi gen MADS-box pada buah abnormal kelapa sawit. Teknik UPLC saya gunakan untuk mengecek hubungan antara fenomena metilasi pada DNA genom dengan fenotipe buah abnormal.
  • Dalam penelitian ini, saya melakukan analisis PCR (qPCR) dengan menggunakan primer spesifik untuk gen MADS Box tertentu. Produk PCR yang didapat, selanjutnya dianalisis dengan menggunakan teknik UPLC.
  • Dari hasil analisis UPLC saya mendapatkan hasil yang puncaknya terbelah dua seperti lidah ular, yang seharusnya mempunyai satu puncak. Hal ini sudah diulang beberapa kali, tetapi hasilnya tetap sama.
  • Pertanyaannya: (1) Apakah hal itu dapat dijadikan sebagai indikator terjadinya metilasi pada MADS Box gene yang dianalisis? (2) Apakah hal itu dapat dijadikan sebagai dasar untuk menyimpulkan bahwa penyebab fenomena buah abnormal karena metilasi? (3) Apakah pada lokus gen MADS Box yang dianalisis alelnya heterozigot? (4) apakah hal tersebut menandakan terjadinya mutasi pada lokus MADS Box gene yang dianalisis?
  • Apakah bisa dihubungkan antara ketajaman dan panjangnya puncak (peak) dari hasil UPLC dengan semakin berat atau semakin ringannya abnormallitas buahnya? Jika demikian, apa penjelasannya?

Sebelum menjawab berbagai pertanyaan tersebut, baiklah kita coba mencari kejelasan terlebih dahulu beberapa hal yang terkait dengan teknik dan data yag digunakan.

  • MADS Box genes : adalah kelompok gen regulator (regulatory genes) yang berperanan dalam proses pertumbuhan dan perkembangan tanaman (misalnya: perkembangan buah). Salah satu ciri yang sama untuk kelompok gen ini adalah adanya MADS domain (pada molekul proteinnya) yang disandikan oleh MADS Box (pada molekul DNAnya).
  • Metilasi : proses penambahan gugus metil pada nukleotida target yang berada pada genom tanaman. Proses metilasi dikatalisis oleh ensim metilase. Metilasi merupakan salah satu skim untuk melakukan in-aktivasi ekspresi gen tanpa terjadinya mutasi/modifikasi runutan nukleotida pada genom tanamannya. Suatu gen yang mengalami metilasi hingga level tertentu, dapat menjadi tidak terekspresi (tidak menghasilkan protein) meskipun tidak terjadi mutasi (perubahan) pada runutan DNAnya. Fenomena gene silencing juga diasosiasikan dengan terjadinya metilasi pada runutan nukleotida dari gen (genom) tanaman yang dianalisis.
  • Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) salah satu teknik liquid chromatography, sebagaimana High Performance Liquid Chromatography (HPLC), tetapi dengan beberapa keunggulan tertentu antara lain: lebih cepat, lebih sensitif, dan mampu mendeteksi lebih banyak macam senyawa.
  • Dalam hasil analisis UPLC, ketajaman dan panjangnya puncak (peak) merupakan indikator kemurnian dan kuantitas dari molekul yang dianalisis. Makin tajam puncaknya berarti makin murni. Sedangkan makin tinggi puncaknya berarti makin banyak kuantitas molekul yang direpresentasikan sebagai puncak tersebut.

Selanjutnya, kembali pada pertanyaan yang diajukan di atas – berikut adalah penjelasan yang dapat saya berikan:

  • Hasil yang puncaknya terbelah dua seperti lidah ular, yang seharusnya mempunyai satu puncak, mengindikasikan keberadaan dua macam molekul berbeda yang ukuran molekulnya hampir sama sehingga waktu retensinya hanya sedikit berbeda. Puncak yang seperti lidah ular terjadi karena dua puncak yang diamati overlapping (tumpang tindih) satu dengan yang lain.
  • Dua potongan DNA hasil amplifikasi PCR yang mempunyai  sebagian besar runutan nukleotida sama dan hanya berbeda pada beberapa posisi saja akibat mutasi substitusi BISA menghasilkan pola dua puncak seperti lidah ular dalam analisis UPLC. Dengan demikian, hal itu dapat dijadikan sebagai indikator terjadinya mutasi substitusi pada runutan DNA MADS Box yang diamplifikasi PCR.
  • Jika templat DNAnya diisolasi dari satu individu contoh dan menghasilkan produk amplifikasi PCR untuk lokus MADS Box tertentu yang berbeda ukurannya (berbeda runutan DNAnya akibat substitusi) maka hal itu dapat menjadi indikator bahwa genotipe individu pada lokus MADS Box yang dianalisis adalah heterosigot.
  • Kepastian tentang identitas dua potongan MADS Box hasil amplifikasi PCR yang dianalisis tersebut apakah merupakan molekul yang identik dengan sejumlah mutasi substitusi atau dua molekul yang sama sekali berbeda, tidak dapat disimpulkan hanya dengan data UPLC. Hal ini hanya dapat disimpulkan dengan melakukan DNA sequencing terhadap potongan DNA MADS Box hasil amplifikasi yang didapatkan.
  • Seandainya ada dua potongan DNA yang sama (panjang dan runutan DNA-nya), tetapi yang satu mengalami metilasi dan yang lain tidak mengalami metilasi, apakah UPLC dapat membedakan dua molekul tersebut? Jawabannya dua molekul tersebut BISA dibedakan dengan teknik UPLC. Kemungkinan yang didapat dari analisis UPLC untuk dua molekul tersebut (satu mengalami metilasi, yang lain tidak) kemungkinan akan menghasilkan pola lidah ular tersebut.
  • Permasalahannya adalah, ketika dua molekul yang dianalisis adalah produk PCR maka jelas dua molekul yang dihasilkan dari rekasi PCR TIDAK MUNGKIN mengalami metilasi mengingat proses metilasi dilakukan oleh ensim metilasi dan ensim ini bukan bagian dari reagensia yang digunakan untuk amplifikas PCR. Oleh karenanya, produk PCR yang ketika dianalisis dengan UPLC menghasilkan pola peak bercabang seperti lidah ular, kemungkinan besar bukan karena salah satu molekulnya merupakan molekul yang mengalami metilasi dan yang lain tidak. Pola peak lidah ular lebih mungkin disebabkan oleh terjadinya mutasi substitusi yang menyebabkan perubahan retensi dalam analisis UPLC dari salah satu molekulnya sedikit berubah dan menjadikan peak-nya seperti lidah ular.
  • Dengan demikian, pola peak seperti lidah ular tidak harus dihubungkan dengan metilasi pada MADS Box gene yang dianalisis dan tentu saja tidak selayaknya dijadikan sebagai dasar untuk menyimpulkan bahwa penyebab fenomena buah abnormal pada kelapa sawit terjadi karena metilasi DNA MADS Box tertentu.
  • Poin terakhir dari diskusi kali ini adalah apakah bisa dihubungkan antara ketajaman dan panjangnya puncak (peak) dari hasil UPLC dengan semakin berat atau semakin ringannya abnormallitas buahnya? Untuk menjawab hal ini harus dibuat terlebih dahulu populasi bersegregasi untuk sifat abnormal pada generasi F1 atau F2/BC1, turunan dari hasil silangan antara tetua P1 (abnormal) x tetua P2 (normal) dengan jumlah yang bervariasi sebanyak antara 80-180 individu. Selanjutnya, setiap individu tersebut diamati fenotipe buahnya (normal/abnormal) dan dianalisis tinggkat ekspresi dari dua alel MADS Box yang telah diidentifikasi diatas untuk menentukan kuantitas ekspresinya (bisa dilakukan dengan RT-PCR diikuti analisis UPLC). Jika dari hasil analisisnya ternyata terjadi ko-segregasi antara kuantitas dari molekul tertentu yang dianalisis dengan fenotipe abnormalitas pada individu dalam populasi bersegregasi, maka dapat disimpulkan bahwa level ekspresi terkait dengan tingkat keparahan abnormalitas buah yang diamati. keberadaan Sebaliknya, jika tidak ada korelasi – maka kesimpulannya tidak terkait.

Demikian sedikit ulasan tentang pemakaian teknologi UPLC dalam analisis ekspresi gen yang menjadi pertanyaan seorang alumnia AGH635. Mengakhiri posting ini, saya berharap semoga penjelasan ini ada manfaat dan nilai tambahnya bagi rekan sejawat sekalian. Masukan dan umpan balik rekan sejawat sekalian sangat saya hargai. Semoga informasi ini dapat menjadi secuil ‘Gading dan Belang’ yang dapat saya tinggalkan kepada rekan sejawat yang sempat membacanya.

About PMB Lab: Prof. Sudarsono

This blog is dedicated as a communication media among alumni associated with PMB Lab, Dept. of Agronomy and Horticulture, Fac. of Agriculture, IPB, Bogor – Indonesia. It contains various information related to alumni activities, PMB Lab’s on going activities and other related matters.
This entry was posted in Kuliah (Courses), Q & A and tagged , , , . Bookmark the permalink.

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s