Q&A in AGH634 Course: Aneka Pertanyaan tentang Real Time PCR # 2

Salah satu mahasiswa pascasarjana yang pernah mengambil kuliah AGH635. Teknik Molekuler Seluler dalam Pemuliaan Tanaman bertanya pada saya tentang analisis real-time PCR untuk mempelajari ekspresi gen MADS Box dan hubungannya dengan abnormalitas pembentukan buah pada kelapa sawit. Masalah yang dipertanyakan adalah sebagai berikut:

  • Saya memakai real-time PCR untuk mempelajari ekspresi gen MADS-box pada buah abnormal kelapa sawit. Teknik real-time PCR saya gunakan untuk mengecek hubungan antara terekspresi atau tidaknya gen MADS Box tertentu dengan fenotipe buah abnormal.
  • Sebagai kontrol PCR untuk false positive dalam analisis real-time PCR, saya menggunakan gen Actin sebagai target. Untuk itu telah didisain primer dari ekson 1 dan ekson 2 gen Actin, yang akan mengamplifikasi intron yang diapit oleh kedua ekson tersebut.
  • Pertanyaannya: (1) Jika yang dipakai dasar untuk mendisain primer adalah ekson 1-ekson2, berati diantaranya ada intron. Bagaimana caranya saya mendisain primer yang mengapit intron? (2) Di posisi nukleotida ke berapa dari ekson 1 saya harus memilih sebagai primer forward dan pada nukleotida ke berapa dari ekson2 saya harus memilih sebagai primer reverse-nya? (3) Berapa pasang basa (bp) panjang sekuense (potongan DNA yang akan diamplifikasi PCR? dan (4) berapa pasang basa (bp) panjang potongan DNA yang optimal di amplifikasi dalam analisis real-time PCR?

Sebelum menjawab berbagai pertanyaan tersebut, baiklah kita coba mencari kejelasan terlebih dahulu beberapa hal teknis yang terkait dengan penggunaan kontrol dan disain primer dalam real-time PCR.

  • Salah satu penggunaan teknologi real-time PCR adalah untuk mempelajari ekspresi gen, baik secara kualitatif (menjawab pertanyaan ada atau tidaknya ekspresi gen) maupun kuantitatif (ada ekspresi, hanya berapa banyaknya?).
  • Dalam real-time PCR, templat yang digunakan berupa cDNA yang disintesis dari total mRNA. Dalam hal ini, peneliti harus mengisolasi total mRNA dari suatu jaringan tanaman tertentu dan menggunakan total mRNA yang didapat untuk mendapatkan cDNA. Sintesis cDNA dari mRNA dilakukan dengan bantuan ensim reverse transcriptase.
  • Prinsip dalam analisis real-time PCR adalah: (1)  jika gen target yang dievaluasi terekspresi maka akan ada mRNA yang disandi dari gen target dalam preparasi total mRNA, (2) jika mRNA dari gen target ada maka akan ada molekul cDNA spesifik yang disintesis dari mRNA tersebut, (3) jika cDNA spesifik ada maka ketika dilakukan amplifikasi PCR dengan menggunakan primer spesifik untuk gen target, akan dihasilkan potongan DNA hasil amplifikasi PCR (PCR positif), dan (4) sebaliknya, jika gen target yang dievaluasi tidak terekspresi maka mRNA gen target tidak ada diantara preparasi total mRNA yang diisolasi dan tidak terdapat molekul cDNA spesifik di dalam preparasi cDNA yang disintesis. Akibatnya, ketika diamplifikas PCR dengan menggunakan primer spesifik, tidak akan dihasilkan potongan DNA hasil amplifikasi PCR (PCR negatif).
  • Permasalahan besar yang umum terjadi dalam penyiapan cDNA sebagai templat dalam analisis real time PCR adalah keberadaan kontaminan DNA genomik. Biasanya, kontaminan DNA genomic terdapat dalam preparasi mRNA total yang diisolasi dan digunakan untuk melakukan cDNA sintesis. Ketika ada kontaminan DNA genomik dalam preparasi cDNA yang digunakan sebagai templat, maka real-time PCR tidak dapat lagi digunakan untuk menentukan apakah gen target yang dipelajari terekspresi atau tidak terekspresi. Dalam hal ini, dalam kondisi gen target terekspresi atau tidak terekspresi – hasil real-time PCR-nya akan selalu positif. Fenomena ini dikenal dengan fenomena FALSE POSITIVE.
  • Disebut false positive karena hasil real-time PCR ketika gen target yang dipelajari tidak terekspresi akan memberikan hasil PCR positive dan dalam kondisi gen target yang dipelajati terekspresi juga akan memberikan hasil PCR positive. Hal ini karena real-time PCR tidak dapat membedakan apakah hasil PCR positif yang didapat merupakan produk amplifikasi PCR dengan menggunakan templat cDNA (berarti terjadi ekspresi gen target) atau genomik DNA (dan bukan dengan templat cDNA – berarti sebetulnya tidak terjadi ekspresi gen target).
  • Untuk itu dalam penerapan real-time PCR perlu penggunaan kondisi KONTROL untuk mendeteksi keberadaan kontaminan DNA genomik dalam setiap templat cDNA yang digunakan.  Sebagai kontrol untuk mendeteksi ada tidaknya kontaminan DNA genomik, primer spesifik akan didisain untuk mengamplifikasi intron tertentu dari gen yang digunakan sebagai kontrol. Karena dalam molekul cDNA tidak ada sequence intron sedangkan dalam DNA genomik ada intron, maka hasil amplifikasi PCR untuk gen kontrol akan menghasilkan potongan hasil amplifikasi PCR yang berbada ukurannya, tergantung pada jenis templat yang digunakan.
  • Jika produk amplifikasi PCR didapatkan dengan menggunakan cDNA sebagai templat, maka akan menghasilkan potongan DNA produk PCR yang lebih pendek dibandingkan dengan jika menggunakan DNA genomik karena cDNA tidak mempunyai intron. Sebaliknya, jika menggunakan DNA genomik sebagai templat, maka akan menghasilkan potongan DNA produk PCR yang lebih panjang daripada cDNA karena keberadaan intron yang diapit oleh kedua primernya.

Selanjutnya, kembali pada pertanyaan yang diajukan di atas – berikut adalah penjelasan yang dapat saya berikan:

  • Jawaban dari Pertanyaan (1) – gen target sebagai kontrol yang digunakan adalah gen Actin dan memang sesuai dengan yang saya jelaskan di atas, primernya didisain untuk mengamplifikasi intron yang diapit oleh Ekson 1 dan Ekson 2. Cara mendisain pasangan primer yang mengapit intron, jika anda menggunakan program Primer 3 (http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi): (a) beri tanda […] pada awal dan akhir intronnya, (b) tentukan ukuran PCR produk yang diinginkan, dan (c) pilih/tentukan primernya. Primer 3 akan memilihkan primer yang terbaik berdasarkan sequence ekson 1 (untuk primer Forward) dan ekson 2 (untuk primer Reverse-nya).
  • Contoh: jika xxx adalah bagian nukleotida dari Ekson 1,  yyy adalah bagian nukleotida dari Ekson 2, dan —– adalah bagian dari intron, maka berikan tanda [  ] pada awal dan akhir dari intron yang akan diamplifikasi – sebagaimana diilustrasikan berikut xxxxx [ ———- ] yyyyyy. Jika diterjemahan dalam bahasa manusia, tanda [ ] berarti “tolong buatkan sepasang primer yang akan mengamplifikasi bagian intron (—-) dan primer forwardnya didisain menggunakan sekuens Ekson 1 (di daerah xxx) sedangkan primer reversenya menggunakan sequence  Ekson 2 (di daerah yyy).” Sebetulnya, akan lebih jauh lebih mudah memahaminya jika sambil dipraktekkan, dibandingkan hanya dengan membaca penjelasan tertulis ini.
  • Jawaban dari Pertanyaan (2), tergantung pada beberapa hal, antara lain: (a) berapa ukuran produk amplifikasi PCR yang diinginkan (berapa ukuran produk amplifikasi PCR jika menggunakan templat cDNA? berapa jika templatnya DNA genomik? Jawaban dari pertanyaan ini akan menentukan dimana posisi primernya), (b) berapa panjang intronnya? (cari intron yang tidak terlalu panjang, karena jika terlalu panjang akan mengganggu efektivitas dan efisiensi proses PCR yang menggunakan templat DNA genomik), (c) kriteria primer yang didisain (misalnya berapa Tm-nya, GC/AT rationya, panjang primernya, dan sebagainya), dan berbagai faktor lainnya.
  • Berdasarkan kriteria yang telah ditentukan oleh orang yang mendisain primer tersebut, maka Primer 3 akan membantu menentukan di posisi nukleotida ke berapa pada Ekson 1 – primer Forward- dan di posisi nukleotida ke berapa pada Ekson 2 – primer Reverse yang harus dibuat. Anda tidak perlu melakukannya/menentukannya secara manual lagi. Sekali lagi, penjelasan dalam bentuk praktek langsung menggunakan Primer 3 untuk mendisain primer akan lebih mudah dipahami dibandingkan hanya melalui penjelasan tekstual ini.
  • Jawaban dari Pertanyaan (3) – anda sendiri yang menentukan berapa panjang potongan DNA yang akan diamplifikasi PCR. Tidak ada angka ajaib tertentu yang harus digunakan. Selain itu, sangat tergantung pada gen target yang akan dianalisis. Sebagai rule of thumb : makin panjang ukuran potongan DNA hasil amplifikasi PCR yang didapat – akan makin kurang efektif dan efisien, tetapi jika produknya terlalu pendek juga kurang bagus.
  • Biasanya orang akan mendisain primer yang akan menghasilkan potongan DNA hasil amplifikasi PCR dengan ukuran antara 300 – 500 pasang basa (bp). Dengan demikian, dapat dikatakan bahwa potongan DNA antara 300 – 500 bp merupakan ukuran yang optimal untuk analisis real-time PCR.

About PMB Lab: Prof. Sudarsono

This blog is dedicated as a communication media among alumni associated with PMB Lab, Dept. of Agronomy and Horticulture, Fac. of Agriculture, IPB, Bogor – Indonesia. It contains various information related to alumni activities, PMB Lab’s on going activities and other related matters.
This entry was posted in Kuliah (Courses), Q & A and tagged , , , , , , . Bookmark the permalink.

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s